SCI赏图录，是将SCI中的图表一个一个摘录出来，从分析解读到消化吸收，最后实操重现运用。今天我们解读的figure如下

　　为了进一步确定MCTS1的表达，对31例原发性乳腺癌组织与非癌组织配对的队列进行了免疫组化染色。该队列中有31名女性，平均年龄为50.4岁(26-78岁)。80.6%(25/31)的乳腺癌组织MCTS1表达经免疫组化上调。代表性图像如图2所示。

　　免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。

　　1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织切片在室温中放置60分钟或 60℃恒温箱中烘烤20分钟。

　　a 组织切片置于二甲苯中浸泡 10 分钟,更换二甲苯后再浸泡10 分钟。

　　a高压热修复在沸水中加入EDTA(pH8.0)或 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0），盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。缓慢加压，玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

　　c 酶消化方法 常用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热 37℃，消化时间约为 5-30 分钟。

　　（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在组织切片上，室温静置 10 分钟。

　　（8）滴加 Ι 抗 50μl,室温静置 1 小时或 4℃过夜或 37℃1 小时

　　（3）用蒸馏水或 PBS 配制新鲜的 3%H2O2，室温封闭 5-10 分钟，用蒸馏水洗 3 次

　　（7）滴加 Ι 抗 50μl,室温静置 1 小时或 4℃过夜或 37℃1 小时

　　a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温 1 小时或 4 度过夜

　　c DAB 显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过 5-12 分钟，以显微镜下观察为准

　　b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜 3%H2O2 封闭孵育时间延长

　　a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于 60 分钟

　　c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释

　　d 室温太低 低于 15 度 要改放在 37 度孵育箱孵育 30-60 分钟或 4 度冰箱过夜

　　（1）固定：最好用 4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；

　　但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

　　Bouin S 固定液：饱和苦味酸 750ml，甲醛 250ml，冰醋酸 50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存三亿体育官方网站。

　　PLP 液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

　　（3）切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

　　（4）烤片：60℃ 30 分钟或 37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

　　Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按 1:10 稀释成 60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES 和 Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在 APES 1：50 丙酮溶液中浸泡 3分钟，晾干，即可进行下一步。

　　（7）灭活内源性酶：HRP 系统：3%双氧水灭活；AP 系统：3%HAc 灭活。

　　（8）暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

　　（9）封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

　　（10）抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于 PBS 稀释的抗体一定要当天使用。

　　（11）背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含 1‰ Tween20 的 PBS 洗，特别是在显色之前要多洗。

　　（12）返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如 PBS）或 Na2HPO4 的饱和溶液返蓝。

　　1)更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。

　　2)数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉

　　3)免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在 250 左右。

　　恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。

　　组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好 2h 内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到 3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过 0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规 HE理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而 HE 染色的常规组织处理是采用 10%的中性缓冲或 4%缓冲多聚甲醛 4 倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在 l2h 内，一般固定时间不应超过 24 小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

　　组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水 lh×3 次，二甲苯透明 lh×2 次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过 65℃。

　　组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染色操作程序复杂，时间较长，有些抗原是要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。

　　1)Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸) 一般采用分子量 30000 左右的 0.5%多聚赖氨酸最好，也可用试剂公司出售的其浓溶液以 1：10 去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中，倾尽余液，在 60℃温箱中烤干备用，此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。

　　一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。

　　常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用 3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为 3%一 5%，时间不宜过长，最好室温 10min。

　　在正常组织细胞中也含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行 0.01%卵白素溶液室温处理 20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。

　　最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6~8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用 0.05mo1/L 酒石酸抑制。

　　非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是 2%~10%羊血清或 2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min 即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含 1%非免疫血清的 pH7.4 的 PBS 液。

　　经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时，浸泡切片的缓冲液的离子强度和 PH 值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下凡种：

　　主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为 0.1%，37℃作用 10min。配法：0.1g胰蛋白酶加入到 0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。

　　2）胃蛋白酶(Pepsin)主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为 0.4%，37℃作用 30min。配法：0.4g 胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl 水溶液中。

　　HIER 对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用更加明显，最常用的抗原修复液是 pH6.0 的枸橼酸缓冲液和 pH8.0 的 EDTA 缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。抗原修复液的 pH 值非常重要，有效的抗原修复 pH 值要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着 pH 值的升高染色的强度逐渐增强，但最佳 pH 值范围为6.0~10.0，对于大多数抗原这个范围的 pH 值都能进行有效的修复，在进行HIER过程中应防止切片的干燥，加热时必须达到规定的温度，保温时间要足够，对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER 处理，否则对染色无益，但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。HIER 方法有：

　　1)水浴加热法:将脱蜡人水后的切片放人盛有修复的容器中，放人加热煮沸水中，当修复液温度达到 95℃左右时计时 l5min，自然冷却，PBS 洗 3min×3 次。

　　2)微波加热法:将切片放入修复液中微波加热使温度在 96℃左右，计时 l0min，在微波炉中停留 2min，室温自然冷却，PBS 洗 3min×3 次。

　　免疫组化染色的显色是最后的关键问题，一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB 或 AEC 显色系统进行显色。但要得最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到最强显色而背景无色为最终点，尤其 DAB 显色时间短着色浅，时间长背景又深，都将影响结果判断，根据经验 DAB 在配制完后最长宜放置 30min 以内，过时不能使用，DAB加到组织切片时作用时间最长不宜超过 10min(最好在 5min 内)，否则不管有无阳性都应终止反应。对一些含有内源性酶较高的组织用 DAB 显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制，以达到最佳的分辨效果（棕色）。AEC 显色系统（红色）的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，同时染色的切片也不能久存。如果是碱性磷酸酶(AP)最好选用 NBT/BCIP 作为显色系统（结果染为蓝黑色）。