1.本技术涉及白芷技术领域，尤其涉及白芷多糖组合物及其在排毒、养颜、美白或祛斑中的应用。

　　2.白芷为伞形科植物白芷angelica dahurica(fisch.ex hoffm.)benth.et hook.f.或杭白芷angelica dahurica(fisch.ex hoffm.)benth.et hook.f.var.formosana(boiss.)shan et yuan的干燥根，具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓之功效，国家卫健委列为药食同源的一种中药材。

　　3.白芷主要含有香豆素类、挥发油类、苷类、多糖类、生物碱类和氨基酸类化合物，其中，进过现代药理学证实了其中香豆素类横幅具有应用于化妆品中，起到美白的使用价值。外用中药制剂复方白芷配利用白芷中所含香豆素类成分具有光敏作用这一特性来用于白瘫风的治疗。研究发现卤米松乳膏合并复方白芷配治疗寻常型白瘫风总有效率明显高于单独使用卤米松乳膏。研究表明白芷中佛手柑内脂等部分香豆素类成分具有激活酪氨酸激酶的作用。

　　4.然而，继续开发白芷相关活性成分，探索其在美白、排毒、祛斑等化妆品或保健品的应用前景仍然具有十分现实的意义。

　　5.有鉴于此，本技术的目的在于至少发现一种有别于现有技术的白芷活性成分，并探索其在美白、排毒、祛斑等化妆品或保健品的应用前景。

　　6.第一方面，本技术实施例公开了一种白芷多糖组合物，包括f1～f5中的至少一种，f1～f5均包含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，且其中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比均相同。

　　7.在本技术实施例中，f1包含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔百分比为7.374％、7.374％、4.733％、6.187％、50.006％、20.676％、1.980％和1.670％；

　　8.f2包含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔百分比为7.284％、7.284％、4.675％、6.111％、49.395％、20.423％、2.750％和2.078％；

　　9.f3包含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔百分比为7.316％、7.316％、4.695％、6.137％、49.607％、20.511％、2.516％和1.903％；

　　10.f4包含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔百分比为7.320％、7.320％、4.698％、6.141％、49.638％、20.523％、2.579％和1.781％；

　　11.f5包含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔百分比为7.320％、7.320％、4.698％、6.141％、49.638％、20.523％、2.579％和1.781％。

　　16.第二方面，本技术实施例公开了一种排毒养颜美白祛斑的保健品，该保健品包含第一方面所述的白芷多糖组合物，质量百分比为0.001～20wt％。

　　17.在本技术实施例中，所述保健品还包含保健品学上或化妆品学上能够接受的辅料，所述辅料包括湿剂、柔软剂、防腐剂、ph调节剂、有机和无机颜料、香料、凉爽剂、止汗剂、稳定化剂、水化剂或油化促进剂、稀释剂、粘合剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂中的至少一种。

　　18.第三方面，本技术实施例公开了一种排毒养颜美白祛斑口服剂，包括0.001～10质量份的第一方面所述的白芷多糖组合物、100～500质量份的稀释剂和20～50质量份的粘合剂。

　　19.第四方面，本技术实施例公开了一种排毒养颜美白祛斑乳膏，包括0.001～20wt％的第一方面所述的白芷多糖组合物、0.5～1.75wt％硬脂酸钠、1.5～2.5wt％聚山梨糖醇60、2.0～4.0wt％聚乙二醇60氢化蓖麻油、1.5～5.0wt％角鲨烷、1.5～5.0wt％辛酸/癸酸甘油三酯、15～35.0wt％甘油、0.5～3.0wt％丙二醇、0.02～0.2wt％三乙醇胺、0.2～2wt％的防腐剂和0.1～0.25wt％香料，余量为水。

　　20.第五方面，本技术实施例公开了第一方面所述的白芷多糖组合物的制备方法，包括以下步骤：

　　21.获得经脱脂处理的白芷滤渣，经乙醇回流、糖苷酶处理后，得到酶解产物，所述酶

　　23.在本技术实施例中，所述酶解处理中使用了包含α-甘露糖苷酶、硫酸铵和乙酸锌的水溶液作为酶解处理剂。

　　24.第六方面，本技术实施例公开了第一方面所述的白芷多糖组合物在制备排毒、养颜、美白或祛斑相关保健品或化妆品中的应用。

　　26.本技术实施例充分利用药食同源的常规中药材白芷的资源，从中开发得到了5种多糖成分，并对其一级结构进行了一定的研究。由此利用该五种白芷多糖作用于黑色瘤细胞，能够抑制其酪氨酸酶活性，减少黑色素生成，并通过对相关基因mrna水平检测，推断该白芷多糖通过抑制mitf、tyr和tyrp1基因的表达来实现抑制其酪氨酸酶活性和减少黑色素生成的调控机制。并最终通过动物实验证实了以5种白芷多糖成分制得的乳膏和片剂具有减少模型小鼠黑色素合成功效，提示本技术实施例提供的5种白芷多糖具有应用祛斑、排毒养颜或美白领域的应用前景。

　　27.图1为本技术实施例1提供的sephadexg-50纯化的洗脱曲线提供的sephadexg-25纯化的洗脱曲线提供的sephadexg-50纯化的洗脱曲线.图5为本技术提供的f1甲基化产物的总离子流图色谱图。

　　37.图11为本技术动物实验提供的阳性1组小鼠皮肤组织切片he染色图。

　　38.图12为本技术动物实验提供的阳性2组小鼠皮肤组织切片he染色图。

　　39.图13为本技术动物实验提供的乳液组(实施例2)小鼠皮肤组织切片he染色图。

　　40.图14为本技术动物实验提供的片剂组(实施例7)小鼠皮肤组织切片he染色图。

　　41.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。

　　48.(2)过滤，得滤渣230g左右，加入至100％的乙醇水溶液回流提取2h后，过滤得滤渣，再次加入至95％的乙醇水溶液回流处理2h后，过滤得到滤渣，再次加入至85％的乙醇水溶液回流处理2h后，过滤，干燥后，得到210g滤渣；

　　49.(3)取210g滤渣，充分分散于2l的ph＝4.5的pbs溶液中，同时加入200ml含有23.5g/l的α-甘露糖苷酶、3.0m硫酸铵和0.1mm乙酸锌水溶液(m7257，sigma-aldrich)，充分搅拌2h后，过夜后转移至90～105℃左右水浴蒸煮2h，以便充分灭酶，并使得相关蛋白变性后，过滤，滤液减压浓缩，得到150ml的浓缩液；

　　50.(4)向150ml的浓缩液中加入40ml的氯仿正丁醇(氯仿:正丁醇体积比为4:1)萃取溶剂充分混合后，静置，取上层清液，3500rpm离心15min，取上清液，加入4倍体积的无水乙醇，充分混合后，静置过夜，4000rpm离心15min，取沉淀物，依次用95％乙醇溶液、无水乙醇、和丙酮各洗涤2次，得到15.3g白芷多糖粗品。

　　51.一个具体的对比例1的提取实施过程为与实施例1大致相同，区别仅在于上述步骤(3)，具体为：

　　52.(3)取200g左右滤渣，加入2l蒸馏水，充分混匀后，转移至90～105℃左右水浴蒸煮2h，过滤取滤渣，再次加水蒸煮处理，合并滤液，滤液减压浓缩。

　　56.sephadexg-50、sephadexg-25均购自ge healthcare，分别准确称取50g，分别用1l去离子水室温充分浸泡24h，反复洗涤至充分溶胀后，再依次用0.5m碱液和0.5m氯化钠溶液分别精品0.5h后，再用去离子水洗涤至中性后，湿法装柱至akta蛋白纯化柱中。

　　58.准确称取上述实施例1和对比例1制得白芷多糖粗品200mg，用2ml的去离子水溶解，0.45μm滤膜过滤，制成上样液，分别上样sephadexg-50和sephadexg-25色谱柱，静置30min后，用去离子水以0.25ml/min的流速洗脱，分部收集，每管5ml，共收集50管，并以苯酚硫酸法检测每管的吸光值，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线决定合并的收集管，冷冻干燥，得到白芷多糖精制冻干粉。

　　60.色谱柱：ultrahydrogel水溶性凝胶色谱柱；流动相为0.1n硝酸钠，柱温30℃，示差折光检测器检测(waters 2424)，进样量20μl，所有的测试结果通过breeze软件(waters chromatography,inc)积分处理。

　　61.标准曲线：取标准葡聚糖(分子量分别为1000,5000,12000,80,150,270,670kda，南京都莱生物技术有限公司)，配成2％的溶液，13 000r/min离心10min，上清液用来制作标准曲线μl，得到色谱图，以出现峰型的洗脱液的洗脱体积(ml)为横坐标，以葡聚糖重均分子量的对数1gmw为纵坐标绘制标准曲线，根据分子量标准曲线.样品测定：取上述凝胶色谱纯化的冻干粉，用流动相溶解，配制成10mg/ml溶液，

　　0.45μm滤膜过滤，采用上述条件进样检测，根据保留时间代入标准曲线，计算即可得到对应的分子量。

　　64.称取白芷多糖精制冻干粉纯品2mg，用蒸馏水配制成1mg/ml的溶液，在200～400nm下进行紫外全扫描。

　　66.取2mg干燥白芷多糖精制冻干粉纯品，用kb压片后ir扫描，扫描范围4000～400cm-1

　　68.采用离子色谱法对f1～f5中单糖组成种类和浓度进行定性定量分析：

　　69.预处理：分别准确配制含1mg/ml的f1、f2、f3、f4和f5样品的2m三氟乙酸(trifluoroacetic acid tfa)，取2ml于110℃条件下处理6h，使其水解；然后将水解产物于40℃下旋转蒸干，再加入3ml的trisil试剂(吡啶：六甲基二硅胺烷：三甲基氯硅烷＝10:2:1体积比)，于80℃水浴加热处理1h，对其进行硅醚化，反应完成后用氮气吹干，1ml正已烷定容，用gc-ms/ms检测。

　　70.色谱检测条件：trace 1310 gc，tsq 8000 evo三重四极杆质谱仪，tg-5ms毛细管柱，购于美国thermo fisher scientific；organomation n-ev ap氮吹仪，购于美国organomation公司。色谱参数：质谱扫描模式:正离子模式；扫描范围:50-500；气相载气:氮气，流速为1.5ml/min；样品进样方式:不分流，进样量为1μl。气相的升温程序是:从80℃开始，以10℃/min升温至150℃,150℃保持2min，再以1.5℃/min升温至180℃，再以10℃min升温至210℃，210℃保持20min。

　　71.标准品：分别配制100μg/ml鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖和氨基葡萄糖水溶液；在配制成5μg/ml的混合标准溶液；从混合溶液中分别取5、1、0.5、0.1、0.05ml溶液10μg肌醇作为内标，用氮吹仪吹干。用与样品相同的方法进行硅醚化衍生，用上述条件进行gc-ms/ms检测。

　　73.由于糖分子中的连羟基或连三羟基键可在高碘酸钠的氧化作用下个发生特异性断裂；一般而言，每2分子的高碘酸可氧化1个含有连三经基的糖残基并生成1分子的甲酸；消耗1分子的高碘酸可氧化1个含有连二羟基的糖残基但不生成甲酸；若糖链中既不含连三羟基，也不含连二羟基的糖残基，则无法被高碘酸氧化，也不会生成甲酸。因而通过测定高碘酸的消耗量以及甲酸的生成量，来判断糖苷键的类型与连接形式、支链定位和数自等结构信息。

　　75.标准曲线m高碘酸钠溶液，将二者按照体积比为5:0、4:1、3:2、2:3、1:4和0:5的比例混合，分别取各比例混合液0.4ml用蒸馏水定容至50ml后用分光光度计在223nm处测定吸光值。以各比例混合液中的高碘酸钠浓度(mol/l)为横坐标，在223nm处的吸光值(absorbance)为纵坐标，绘制高碘酸钠消耗量的标准曲线.多糖样品消耗高碘酸钠能力的测定：取20mg多糖样品，加入至含有60ml 0.015m高

　　碘酸钠溶液置于避光的棕色磨口瓶内，振荡溶解后置于4℃冰箱黑暗处氧化，并进行周期性的震荡并取样。每次从瓶中取0.4ml，用蒸馏水定容至50ml后在223nm波长处测定吸光值，通过标准曲线计算高碘酸钠消耗量。

　　77.由于经高碘酸氧化后的糖残基之间的连接方式不同，得到的产物也不同。进一步通过smith降解，可以将高碘酸氧化产物还原为稳定性较好的多羟基化合物，例如甘油、赤蓟糖醇和未被氧化的单糖残基。其中可以产生甘油的糖着键键型为(1

　　4,6)。因此可以通过鉴定水解产物，来可以推断糖苷键的种类与分支定位。

　　78.在在高碘酸氧化的基础上进行smith降解。在高碘酸氧化反应完成后，加入过量的nabh4还原24h，然后用冰醋酸除去多余的nabh4，减压蒸干。用1m tfa对nabh4还原物进行酸水解，反应时间为2h。向反应体系中不断加入甲醇减压蒸馏，以除去过量的tfa。然后加入一定量的水溶解样品，用naoh将体系调至中性或弱碱性，减压蒸馏除去水，冷冻干燥获得寡糖。最后对所得寡糖进行甲基化分析。

　　81.称取20.0mg的f1～f5冻干粉，溶溶于5.0ml去离子水，加入0.01mol/l的hcl调整ph值至4.75，然后缓慢加入100.0mg的cmc，持续搅拌反应1-2h，待反应结束后，缓慢加入4ml 2.0mol/l的nabh4，并逐滴加入4mol/l的hcl使ph值维持在7.0，待nabh4加完后，室温静置反应1h。反应结束后，转入透析袋中，流水透析24h，去离子水透析24h，透析完成后冷冻干燥得f1～f5的还原产物。

　　83.各称取10.0mgf1～f5的还原产物，置于干燥的25ml反应瓶中，封口膜密封，然后用注射器扎孔，置于p20:干燥器中干燥24h，加入磁力搅拌子，充氮条件下加入10ml无水dmso，氮气避光密封，用超声波辅助充分溶解后，迅速加入20.0mg naoh粉末，超声辅助反应完成后，置于冰浴中，缓慢加入0.5ml碘甲烷，避光反应1h；待反应结束后，加入3.0ml去离子水淬灭甲基化反应，然后转入透析袋中(3500da)，去离子水透析至反应液澄清为止，将透析完成后的透析液浓缩并冷冻干燥。重复以上操作步骤1-2次，然后采用傅里叶红外光谱检测甲基化多糖样品是否完全甲基化。

　　85.称取5.0mg甲基化f1～f5样品，置于安培瓶中，分别加入5.0ml甲酸溶液，酒精喷灯封口，100℃反应3h，反应结束后，转入氮吹仪中氮气吹干(60℃)，再加入甲醇3.0ml以去除残存的甲酸，重复3次，得多糖解聚产物。解聚产物溶于4.0ml 3.0m的三氟乙酸，转入安培瓶中，酒精喷灯封口，121℃反应2h，反应结束后，转入氮吹仪中氮气吹干(60℃)，再加入甲醇3.0ml以去除残存的三氟乙酸，重复3次，得甲基化f1～f5的水解产物；

　　86.将甲基化f1～f5的水解产物溶解于2.0％硼氢化钠溶液中，室温静置反应2.0h后加入20.0％(v/v)乙酸中和未反应完的硼氢化钠，直至无气泡产生，然后转入氮吹仪中氮气吹干(60℃)，再加入甲醇3.0ml以去除残存的硼酸盐，重复3次，得甲基化f1～f5的水解还原产物。

　　87.向还原产物中依次加入1.0ml乙酸酐和1.0ml吡啶，涡旋混匀，转入安培瓶中，酒精

　　喷灯封口，100℃反应2h，反应结束后，加入4.0ml去离子水以去除未反应完的乙酸酐，加入5.0ml氯仿萃取，重复萃取三次，收集氯仿层，再加入等体积的去离子水洗涤氯仿层3次，收集氯仿层，氮吹法浓缩至200μl左右，得部分甲基化糖醇乙酰化产物(pmaas)，过滤膜，进gc-ms分。

　　88.gc-ms色谱条件:agilent db-sms毛细管柱(30m\0.25mm\0.25μm)；载气:高纯he；柱流量:1.0ml/min；进样量:1.μl；分流比:10:1；进样口温度:260℃；升温程序:初始温度60℃，以5.0℃/min升温至80℃并保持1.0min，再以10℃/min升温至220℃并保持1.0min，最后以20℃/min升温至300℃并保持1.0min。

　　89.质谱条件:电子轰击(ei)离子源；电子能量70ev；离子源温度300℃；接口温度300℃；溶剂延迟时间3.0min；质量扫描范围m/z 30～450amu。

　　92.由图1可知，实施例1经由sephadexg-50纯化的洗脱曲线管的洗脱峰有些偏平；进而继续使用sephadexg-25纯化该部分洗脱合并的浓缩液，得到如图2所示的结果，在sephadexg-25的洗脱曲线.如图3所示的结果可知，对比例1经过sephadexg-50纯化后，仅得到一个第6～13管的洗脱峰。

　　94.由此，分别收集实施例1经由sephadexg-50纯化洗脱的第29～31管洗脱液(命名为f1)、由sephadexg-50纯化洗脱的第7～10管(命名为f2)、第14～18管(命名为f3)和第21～24管(命名为f4)洗脱液，以及收集对比例1经过sephadexg-50纯化后的第6～13管的洗脱峰(命名为f5)，分别进行浓缩后，冷冻干燥，依次得到f1～f5的冻干粉。对f1～f5的冻干粉进行紫外光谱(uv)全扫描检测发现在260～280nm无明显的特征吸收峰，表明本技术实施例1和对比例1制得的f1～f5冻干粉均为多糖成分。

　　95.进一步对f1～f5冻干粉进行相对分子量测定，利用葡聚糖得到的标准曲线的洗脱体积依次为6.625ml、6.745ml、6.828ml、6.867ml和6.205ml，由此代入上述标准曲线拟合方程，经计算依次得到f1～f5的相对分子量分别为6095、4045、3040、2660和25763。

　　97.红外光谱分析f1～f5分析结果如图4所示。3600～320℃m-1

　　出现的宽峰为o-h、c-h键的伸缩振动，样品均为多糖。1665～1635cm-1

　　的吸收峰表明在f1～f5中存在乙酰氨基(-nhcoch3)的c＝o伸缩振动，均为酸性多糖；1200～100℃m-1

　　间比较大的吸收峰由两种大的吸收峰伸缩振动引起的为c-o-h或糖环的c-o-c，均为吡喃糖的特征峰；830cm-1

　　的谱带吸收峰证明f1～f5均含有α-和β-构型的糖苷键。此外，红外分析显示未检测到1730cm-1

　　100.组分f1f2f3f4f5鼠李糖7.3747.2847.3167.3207.462

　　阿拉伯糖7.3747.2847.3167.3207.462木糖4.7334.6754.6954.6984.789甘露糖6.1876.1116.1376.1416.260葡萄糖50.00649.39549.60749.63850.601半乳糖20.67620.42320.51120.52320.921葡萄糖醛酸1.9802.7502.5162.5791.628半乳糖醛酸1.6702.0781.9031.7810.876

　　102.高碘酸氧化结果如表2可知，f1～f5被高碘酸氧化后高碘酸消耗量与生成甲酸的量均大于2，说明其中含有的葡聚糖键型均包括i型：1

　　2,46的连接键型。smith降解产物进行气相色谱检测发现，其中有大量甘油检测，而无赤藓醇检测，说明f1～f5中含有大量的i型糖苷键，且不含有ii型中1

　　104.组分高碘酸消耗量(mol/mol)生成甲酸量(mol/mol)葡聚糖的键型f10.6850.327i、ii和iii型f20.6770.3165i、ii和iii型f30.6580.3038i、ii和iii型f40.6430.3142i、ii和iii型f50.7680.3738i、ii和iii型

　　105.由于f1～f5中均含有糖醛酸，因此经过还原后的红外图谱发现其在3390cm-1

　　处无明显特征峰，说明糖醛酸还原完全。将完全还原后的f1～f5进行完全甲基化，得到糖醇乙酸酯衍生物(pmaas)，再经gs-ms测定，得到f1～f5的pmaas的总离子流图和相应的质谱图，将所得的pmaas峰对应的质谱图与美国佐治亚大学糖复合物研究汇总的标准谱库((the ccrc spectral database for pmaa

　　)和中国科学院化学数据进行比对，确定甲基化糖残基的类型，同时依据色谱峰的峰面积计算各甲基化糖残基相对摩尔百分比，最终得到两种多糖组分的糖苷键类型和摩尔百分比，具体统计结果见表3、4、5。

　　表3中，“—”表示未检出。由表3可知，f5的糖苷键键型分布最广，而f1～f4的键型分布最为集中。f4最为集中，包括

　　小鼠黑色瘤细胞(b16)，北京索莱宝科技有限公司，货号：scc-211111。

　　供试品溶液：f1～f5的白芷多糖冻干粉分别用蒸馏水配制成水溶液，以作为供试品溶液。

　　将1ml细胞悬液的冻存管于37℃水浴解冻后，加入4ml含10％的rpmi-1640培养基中，于37℃、5％co2培养至细胞密度达80％以上，即可进行传代培养。悬浮传代培养：收集细胞，100rpm离心5min，弃去上清液，补加1～2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中，以作为模型细胞。

　　104/ml后加入96孔培养板，每孔100μl，分为模型组、实验组和阳性组。其中，模型组细胞加入100μl的培养基；阳性组加入100μl 100μm的8-甲氧补骨脂素(8-mop，维克奇)水溶液；实验组分别加入100mg/l的f1～f5，每一浓度设3个复孔；于37℃、5％co2培养56h，倒置显微镜观察细胞形态变化。并用cck-8试剂盒(翌圣生物)检测各组细胞的存活率。

　　在上述的实验组、模型组和阳性组56后，去除上清液，用ph＝7.4pbs清洗三次，加入200μl含10％dmso的碱液，80℃恒温水浴保温2h，充分裂解细胞和黑素颗粒，同时用酶标仪于490nm处测定od值，则黑色合成率(％)＝(a－b)/b)

　　100％，其中，a表示每组细胞经上述裂解后的od值，b为原代黑色素细胞经上述裂解后的od值。

　　采用上述相同分组实验，细胞培养56h后，弃去培养液，pbs(ph＝7.4)洗涤2次，每孔加入1％triton x-100溶液90μl，迅速放入-80℃冰箱内30min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温后加入10g/l l-dopa溶液(100μl/孔，左旋多巴，cas no.59-92-7，medchemexpress)，37℃孵育30min酶标仪检测490nm处吸光度值(od)，按以下公式计算酪氨酸酶激活率(％)＝(a－b)/b)

　　100％，其中，a表示每组细胞经上述裂解后的od值，b为原代黑色素细胞经上述裂解后的od值。

　　使用rna synthesis assay试剂盒(ab228561)，提取上述分组实验的各组细胞总rna，用反转录试剂盒(qiagen，德国)反转成cdna，以其模板，按照sybr premix ex taq ii加10μl，模板dna加1μl，上、下游引物各加0.4μl，depc水加至20μl的反应体系进行pcr，其反应程序为：95℃预变性10min，95℃15s，56℃或60℃30s，70℃20s，40个循环。每组设置3个重复，在冰上按照以下依次加样，结束反应后，观察熔解曲线，判定靶基因与内参基因反应的特异性，实验组和对照组的mrna相对表达量使用2-δδct

　　所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。

　　如图6所示，经传代后的黑素瘤细胞形态呈长梭型，镜下可观察到正在分裂增殖的黑素细胞。如图7可见，8-mop给药56h后，对黑色瘤细胞的分裂明显，说明阳性组细胞增殖加速；而模型组细胞表现出相同趋势(图8)。

　　由表7可知，虽然实验组细胞的存活率均不如阳性组和模型组，但是其存活率均超过了90％，由此说明，本技术实施例提供的白芷多糖对黑色瘤细胞无明显毒性。

　　由表7可知，模型组和阳性组黑色素细胞的黑色素合成率和酪氨酸酶激活率均显著高于实验组，由此说明，本技术实施例提供的白芷多糖作用于黑色瘤细胞后，能够明显抑制其酪氨酸酶活性，进而减少其黑色素合成。

　　由表8可知，相对于正常组，模型组和阳性组的黑色瘤细胞中mitf、tyr和tyrp1相对mrna水平均显著升高，表明模型组和阳性组在上述实验中不仅酪氨酸酶活性提升，黑色素合成率上升，而且其mitf、tyr和tyrp1基因表达上调。而实验组中，f1～f5干预模型细胞后，其相关基因表达下调至与正常组相当，表达受到抑制。由此推测，本技术实施例提供的f1～f5的白芷多糖可能通过调控mitf、tyr和tyrp1基因表达来实现对黑色瘤细胞酪氨酸酶活性和黑色素合成的分子调节机制。

　　昆明种雌性小鼠，体重20g左右，货号cs-003，辽宁长生生物，在自然条件相同的情况下，室温:20～25℃，湿度:20～30％，自由摄食、饮水，饲养10天适应环境后再开始进行实验。

　　基于上述本技术实施例提供的白芷多糖，本技术实施例还公开了一种排毒养颜美白祛斑的保健品，该保健品包含f1～f5多糖中的至少一种，质量百分比为0.001～20wt％，“wt％”术语表示质量百分比。

　　具体的，本技术实施例提供的保健品能够是内服剂或外用的护肤品能够以化妆品组成物剂型，可以含有化妆品学或皮肤科学上允许的介质或基剂而剂型化。

　　具体的，本技术提供的外用护肤品或化妆品可提供适用于局部使用的所有剂型，例如溶液、油相分散在水相里得到的乳液、水相分散在油相里得到的乳液、悬浮液、固体、凝胶、粉末、膏体、泡沫(foam)或气溶胶组成物的剂型。具体地说，本发明的组成物能够以面霜、护肤水、乳液、散粉、软膏、喷剂或遮瑕棒等形式提供。这些剂型的组成物可以根据本领域的通常方法制备。

　　进一步的，本技术实施例提供的皮肤外用护肤品，还进一步包含有保湿剂、柔软剂、防腐剂、ph调节剂、有机和无机颜料、香料、凉爽剂、止汗剂、稳定化剂、水化剂或油化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等这些化妆品学上可接受的辅料。

　　本技术实施例提供的皮肤外用护肤品并不特别限定其剂型，可剂型化为例如柔肤化妆水、紧肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩膏、精华素、眼霜、眼部精华、面膜、散粉、润肤水、润肤露、润肤油以及皮肤精华素等化妆品。

　　具体的，本技术实施例提供一种排毒养颜美白祛斑乳膏，包括0.001～20wt％的f1～f5的冻干粉、0.5～1.75wt％硬脂酸钠、1.5～2.5wt％聚山梨糖醇60、2.0～4.0wt％聚乙二醇60氢化蓖麻油、1.5～5.0wt％角鲨烷、1.5～5.0wt％辛酸/癸酸甘油三酯、15～35.0wt％甘油、0.5～3.0wt％丙二醇、0.02～0.2wt％三乙醇胺、0.2～2wt％的防腐剂和0.1～0.25wt％香料，余量为水。

　　具体的，本技术实施例提供一种排毒养颜美白祛斑口服剂，包括0.001～10质量份的f1～f5中至少之一三亿体育官方网站、100～500质量份的稀释剂和20～50质量份的粘合剂。其中，“份”至任意质量，仅用于区分不同组分之间的相对质量，而不指代其绝对质量。

　　具体的，所述稀释剂选自淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、山梨醇和微粉硅胶中的至少一种。

　　具体的，所述粘合剂选自硬脂酸镁、葡萄糖、蔗糖、羟丙甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、淀粉和糊精中的至少一种。

　　具体的，该口服剂可为颗粒剂，其制备过程可为：在高速混合制粒机中，加入甘露醇100份，取10份f1冻干粉溶于50ml水中，在搅拌下加入到甘露醇中，搅拌12min，过20目筛，制粒，将颗粒经干燥箱烘干，加入5份硬脂酸镁混合均匀后，转移至压片机上压片，调整片重为0.1g，制成1000片，即得f1的口服片剂。

　　将昆明种小鼠随机分为正常组、模型组、乳膏组、片剂组、阳性1组和阳性2组，每组20只。

　　建立黄褐斑小鼠模型：以剃毛器剃去小鼠脊柱两侧形成2cm2的无毛区，用光谱值为320nm采用中波紫外线]

　　乳膏组：造模完成后，于小鼠造模区每日涂拭1g如表9所示的乳膏，用薄膜和纱布固定。连接涂抹2周。

　　片剂组：造模完成后，小鼠连续内服如表9所示的片剂4周，每日10mg/20g体重。

　　阳性1组：造模完成后，于小鼠造模区每日涂拭1g敬修堂祛斑霜(广药敬修堂佰化

　　阳性2组：造模完成后，小鼠连续内服景天祛斑片(福瑞堂)4周，每日10mg/20g体重。

　　干预治疗4周后，各组小鼠，眼眶采血，将所有小鼠颈椎脱臼处死，迅速取其脱毛后皮肤组织标本。

　　血液样品以2500r/min离心15min，取上清液，按酪氨酸酶检测试剂盒(货号cs0730，sigma-aldrich)说明书操作，进行指标测定。

　　1.0cm)10％固定，常规石蜡包埋切片，黑色素标记采用免疫组织化学技术，再经脱蜡至水，抗原修复后，用hivb45为第一抗体，免疫组化二步法，dab显色，苏木素复染。用pbs代替一抗做阴性对照，光学显微镜下计算各组黑色素细胞个数。

　　黑色素用cmos计算机图像处理系统和专用软件进行图象分析，每例观察5个不同视野。确定切片中的黑色素细胞后，用多功能真彩色细胞图象分析管理系统对目标图象进行定其染色程度并进行免疫组化评分(immunohistochemical score,his)。评分方法如下：a为阳性细胞百分率，a《5％为0分，5％～25％为1分，25％～50％为2分，50％～75％为3分，75％～100％为4分；b为阳性细胞染色程度，b为阴性为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分。a、b两项乘积即为该例组织的his，并根据图象分析管理系统计算出平均光密度和积分光密度。

　　所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用spss13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。

　　由表10可知，相对正常组，模型组小鼠血清样品中酪氨酸酶活显著高于正常组，说明造模成功；阳性1组和阳性2组小鼠血清样品中酪氨酸酶活略低于模型组，对模型组小鼠具有一定干预作用。

　　而乳膏组中，实施例2～6提供的乳膏涂抹模型小鼠后，其酪氨酸酶活显著低于模型组，也显著低于阳性1组，同样地，实施例7、8提供的乳膏涂抹模型小鼠后，其酪氨酸酶活显著低于模型组，也显著低于阳性2组。说明采用本技术实施例提供的以白芷f1～f5为基础制得的乳膏干预黄褐斑小鼠后，具有抑制酪氨酸酶活的作用。

　　为进一步探究各组小鼠皮肤组织黑色素生成情况，本实验还对各组小鼠皮肤组织进行切片染色和观察，结果如图9所示，正常组小鼠皮肤组织鳞状上皮较薄，无增生，由排列整齐的基底细胞和棘细胞组成，表面有少量角质；真皮中见正常的毛囊、皮脂腺，未见汗腺、血管、炎性细胞；结缔组织、皮下脂肪及肌肉组织未见特殊。

　　如图10所示，模型组小鼠皮肤的上皮层较空白组增生明显，角质层增厚，表皮细胞数增多，毛囊和皮脂腺增生明显，血管、炎性细胞增多。

　　如图11、12所示，阳性1组和阳性2组的细胞层数量小于模型组，上皮层仍有增生明显，炎性细胞并未见明显衰减。

　　如图13所示，乳液组小鼠皮肤具有2～3层上皮层数量，接近正常组，部分上皮增生轻微，毛囊，皮脂腺分泌较模型组显著下降，基本无增生，接近常对照组。

　　如图14所示，片剂组小鼠皮肤上皮层变薄，细胞排列松散，附属器增生较少，毛囊、皮脂腺的数量低于模型组。

　　另外，由表10可知，相对于正常组，模型组小鼠皮肤组织的his评分显著高于正常组，说明黄褐斑模型小鼠造模成功；阳性1组和2组的his评分略低于模型组，对模型组小鼠具有一定干预作用。而乳膏组中，实施例2～6提供的乳膏涂抹模型小鼠后，其his评分显著低于模型组，也显著低于阳性1组；同样地，实施例7、8提供的乳膏涂抹模型小鼠后，其his评分显著低于模型组，也显著低于阳性2组。说明采用本技术实施例提供的以白芷f1～f5为基础制得的乳膏干预黄褐斑小鼠后，具有抑制酪氨酸酶活的作用，减少黑色素合成的作用。

　　综上所述，本技术实施例充分利用药食同源的常规中药材白芷的资源，从中开发得到了5种多糖成分，并对其一级结构进行了一定研究。由此利用该五种白芷多糖作用于黑色瘤细胞，能够抑制其酪氨酸酶活性，减少黑色素生成，并通过对相关基因mrna水平检测，推断该白芷多糖通过抑制mitf、tyr和tyrp1基因的表达来实现抑制其酪氨酸酶活性和减少黑色素生成的调控机制。并最终通过动物实验证实了以5种白芷多糖成分制得的乳膏和片剂具有减少模型小鼠黑色素合成功效，提示本技术实施例提供的5种白芷多糖具有应用祛斑、排毒养颜或美白领域的应用前景。

　　以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。

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